macroevolution (macroevolution) wrote,
macroevolution
macroevolution

Происхождение жизни: откуда взялся первый репликатор?

ПРОДОЛЖЕНИЕ

Препятствие 5: Проблема реактивации. Активированные нуклеотиды гидролизуются, что снижает эффективность НР, а как реактивировать гидролизованные нуклеотиды, не разрушив копируемую матрицу, непонятно. Существующие способы реактивации нуклеотидов портят матрицу. Химики ищут новые подходы и реагенты, но самый очевидный способ справиться с проблемой – перейти от замкнутой системы к проточной. РНК-матрицы (или мембранные пузырьки, их содержащие) нужно закрепить (например, на поверхности минералов) и поместить в проточную систему с постоянным притоком свежих активированных нуклеотидов (из близлежащего «маленького теплого пруда Сазерленда-Дарвина», см.: Химики преодолели главное препятствие на пути к абиогенному синтезу РНК [http://elementy.ru/news/431082]).

Препятствие 6: Двухвалентные ионы металлов, высокая концентрация которых необходима для НР, катализируют не только НР, но и деградацию одноцепочечных РНК и разрушение столь любимых Шостаком липидных мембран «протоклеток». Кроме того, они повышают температуру плавления РНК-дуплексов (см. Препятствие 2)

Красивое решение этой проблемы было найдено Шостаком вскоре после публикации обсуждаемой статьи (см.: Синтез РНК в «протоклетках» всё-таки возможен; Adamala, Szostak, 2013).

Шостак и его ученица Катажина Адамала задумались о подборе хелатора, то есть такой молекулы, которая, соединяясь с ионом магния, обхватывала бы его, как клешня, и лишала некоторых каталитических свойств, сохранив нужные.

Исследователи испытали множество хелаторов и обнаружили, что некоторые из них (в том числе цитрат, изоцитрат, оксалат) эффективно защищают мембраны протоклеток от разрушения ионами магния. Однако большинство из этих веществ лишило ионы магния также и способности катализировать репликацию РНК. Исключением оказался цитрат: в его присутствии катализируемая ионами магния репликация лишь чуть-чуть замедлилась. Более того, цитрат полностью лишил ионы магния способности разрушать однонитевые молекулы РНК.

Установив эти факты, авторы перешли к решающему эксперименту. Они изготовили мембранные пузырьки — протоклетки с молекулами РНК внутри. К каждой однонитевой матрице заранее прикреплялся праймер — фрагмент комплементарной последовательности, образующий с матрицей двойную спираль. При этом у матрицы оставался однонитевой хвостик, состоявший либо из нескольких нуклеотидов Ц (неферментативная репликация таких последовательностей идет быстрее всего), либо из чередующихся Г и Ц. Все молекулы РНК, оказавшиеся вне протоклеток, были тщательно удалены. Затем в среду, где плавали протоклетки, добавили хлорид магния, лимонную кислоту и нуклеотиды, активированные имидазолом.

Опыт удался: через 2–3 дня большинство однонитевых участков молекул РНК в протоклетках оказались полностью реплицированы, то есть молекулы стали целиком двуспиральными. В ходе работы подтвердилось предположение (см. Препятствие 5), что репликацию можно ускорить, если не просто добавлять в раствор «пищу» (активированные нуклеотиды) по мере необходимости, а сделать систему проточной и удалять «отходы» (например, нуклеотиды, подвергшиеся незапланированному гидролизу) при помощи диализа.

Еще один небольшой, но приятный сюрприз ждал авторов, когда они проверили, не повлиял ли цитрат на температуру плавления двуспиральных РНК (которая, как мы помним, повышается в присутствии ионов магния). Оказалось, что температура плавления немного снизилась — с 75 до 71°C.

Таким образом, простейшая мера — добавление правильного хелатора — позволила преодолеть сразу несколько препятствий на пути к эффективной НР в протоклетках.

Осталось понять, мог ли присутствовать абиогенно синтезированный цитрат в древних водоемах, служивших колыбелью зарождающейся жизни. До самого недавнего времени правдоподобные способы абиогенного синтеза цитрата не были известны. Ситуация изменилась в августе 2013 года, когда группа американских ученых сообщила о том, что им удалось найти реалистичный путь абиогенного синтеза щавелевоуксусной кислоты (оксалоацетата) (Butch et al., 2013). От этого вещества до цитрата уже рукой подать (они соседи по циклу Кребса).

Однако Шостак и Адамала высказывают гипотезу, которая выглядит более интересной и глубокой, чем предположение о наличии абиогенного цитрата в «колыбели жизни». Роль хелатора, подавляющего негативные эффекты ионов Mg2+ и помогающего им катализировать репликацию РНК, могли взять на себя короткие пептиды, состоящие из нескольких аминокислот с отрицательно заряженными радикалами, таких как аспарагиновая кислота. Современные клеточные РНК-полимеразы имеют в своем активном центре ион магния, удерживаемый тремя остатками аспарагиновой кислоты. К тому же эта аминокислота часто встречается в метеоритах и легко образуется в опытах по абиогенному синтезу органики (таких как опыт Стэнли Миллера). Наличие абиогенных аминокислот и простейших пептидов в «колыбели жизни» считается высоковероятным. С появления простых рибозимов, катализирующих соединение аминокислот друг с другом, скорее всего, началась эволюция белкового синтеза (см.: Тайна происхождения рибосом разгадана? ; Bokov, Steinberg? 2009). шостак и его коллеги в настоящее время пытаются найти простые пептиды, способные помочь магнию катализировать репликацию РНК лучше, чем это делает цитрат. На мой взгляд, это в высшей степени перспективный путь. «Содружество» пептидов с РНК должно было сформироваться задолго, очень задолго до появления матричного белкового синтеза (трансляции).

Препятствие 7: Проблема праймеров. Откуда их брать? Особенно остро эта проблема стоит для «протоклеток», потому что протоклетка не может всасывать готовые праймеры извне – олигонуклеотиды длинее 3 нт не проходят через мембраны.

По мнению Шостака, должен существовать способ «беспраймерной» НР: моно- или олигонуклеотиды комплементарно пристраиваются прямо посередине матрицы, потом к ним пристраиваются другие, кусочки лигируются, просветы заполняются... Эти возможности мало изучены: в экспериментах по НР всегда используются заранее приделанные праймеры; сам Шостак поступает так же.

От себя добавлю: проблема праймеров в пре-РНК-мире (в мире неферментативной репликации) могла привести к тому, что селективное преимущество получали (=быстрее размножались) те молекулы РНК, которым легче было найти себе праймер. То есть те, которые либо сами могли служить себе праймерами для само-удлинения (вариант «шпилька с хвостиком»), либо для которых в окружающей среде (протоклетке, минеральной микрополости) было много подходящих праймеров; удобнейшим вариантом была бы способность молекулы РНК служить праймером для репликации собственных копий или реплик.

Проблема 8: Обратное слипание комплементарных цепочек (strand reannealing) – происходит гораздо быстрее, чем НР, и делает НР невозможной: получается стабильная двухцепочечная РНК, которая не может реплицироваться путем НР, пока цепочки не разъединятся. Простейший путь решения проблемы – уменьшить концентрацию РНК (матриц) в системе. Потому что скорость «обратного слипания» пропорциональна квадрату их концентрации. Т.е. фактически данная проблема сводится к ограничению концентрации размножаемых молекул в среде: если концентрация превышена, НР тормозится.

Даже в ходе PCR, где все делают белковые ферменты (с колоссальной скоростью), проблема обратного слипания не позволяет достигать слишком высоких концентраций (>>1 μM) размножаемой последовательности. А НР идет страшно медленно, поэтому допустимые максимальные концентрации должны быть крайне низкими (порядка 1 nM). Это соответствует всего нескольким молекулам на протоклетку диаметром в несколько мкм. А несколько молекул примитивного, неоптимального рибозима едва ли могли сделать хоть что-то, приносящее заметную пользу протоклетке.

Замедлить обратное склеивание может, например, сложная вторичная структура РНК: если молекула свернется в клубок со шпильками, она уже не слипнется с комплементарной цепью – но, конечно, и реплицироваться путем НР такой клубок будет с большим трудом.

Возможный путь решения: быстрое прилипание коротких комплементарных олигонуклеотидов (уже упоминавшихся выше) к разделившимся цепочкам может противостоять обратному склеиванию – а заодно и стимулировать дальнейшую НР, ведь такие прилипшие тут и там олигонуклеотиды – это промежуточные стадии НР, они могут затем нарастать на 3’ концах, лигироваться и т.д. Для этого надо, чтобы коротких комплементарных олигонуклеотидов было достаточно много.

***********

Шостак представляет себе колыбель жизни как геотермальный район с многочисленными прудами и озерами, сообщающимися, проточными и стоячими; в воду озера периодически поступают горячие выбросы, но большую часть времени там прохладно... «lakes or ponds could accumulate organic compounds to high levels, especially in geothermally active regions where fatty acids and related compounds might be synthesized by Fischer-Tropsch type chemistry, and high energy carbonnitrogen compounds could be synthesized as a result of electrical discharges surrounding active volcanoes. Sulfurous exhalations such as COS and H2S could be important for the synthesis of thioesters or N-carboxyanhydrides for re-activation chemistry, and for the synthesis of modified nucleosides such as 2-thio-U for improved rate and fidelity of RNA replication».

Первыми функциональными рибозимами, по Шостаку, скорее всего были какие-нибудь метаболические рибозимы, например, ускорявшие синтез фосфолипидов (что способствовало росту и делению протоклеток). Какие-нибудь реактивирующие рибозимы; нуклеазы, обрезающие перекрывающиеся концы у олигонуклеотидов (это ускоряло бы НР) и т.д. и т.п.  Репликация РНК шла сначала неферментативно. В конце концов лигазы и полимеразы стали помогать репликации, ускорять ее, но нет оснований полагать, что эти функции появились первыми!

И нам не нужно больше предполагать, что полимеры, случайно насинтезировавшиеся в диких количествах на древней земле, ну вот просто так чисто случайно обладали свойством комплементарности, т.е. были потенциально способны направлять процесс самокопирования. Нет, комплементарность должна была работать с самого начала, уже на этапе "предварительного" синтеза. И уже на этом этапе мог идти отбор.

5. Палиндромный мир (или мир коротких палиндромных повторов).

Здесь я попробую вставить свои 5 копеек. На мой взгляд, главный вывод из всего сказанного состоит в следующем. Если представить, что где-то на ранней Земле или другом теле ранней Солнечной системы некогда существовали благоприятные условия для: 1) спонтанной полимеризации олигонуклеотидов на минеральных матрицах, 2) неферментативной репликации,

то в таком мире дарвиновский (или квази-дарвиновский) эволюционный процесс мог начаться задолго до появления рибозимов-полимераз.

Один из вариантов такого процесса упомянут выше в «Препятствии 7». «Проблема праймеров» могла привести к естественному отбору таких последовательностей, которые могли служить праймерами для самих себя или собственных копий (или комплементарных реплик). В таком случае нетрудно увидеть, что селективное преимущество могли получить последовательности, состоящие из коротких палиндромов.

Например, такая последовательность:
(чтобы не глючили шрифты, вставляю картинками)

palindrom1
Эти две последовательности (они, кстати, одинаковые: в мире палиндромных повторов матрица и реплика идентичны, когда число блоков четное) разъединятся (в горячей фазе цикла) а потом смогут снова склеиться; опять-таки по разному: 1) по всей длине, тогда НР не пойдет, придется ждать следующей горячей фазы; 2) внахлест со свободными 3’ концами, НР тоже не идет; 3) внахлест со свободными 5’ концами – в этом случае опять получится взаимный прайминг и удлинение:
palindrom2
В этом суть идеи: палиндромные последовательности будут размножаться быстрее всех из-за способности к "само-праймингу".

Таким  образом, получаем растущие цепи палиндромных повторов с тенденцией к бесконечному росту.

Конечно, к этому надо добавить происходящие время от времени случайные разрывы растущих цепей. И любой обрывок сможет выступать в роли праймера и снова удлиняться.

Конечно, к этому надо добавить формирование вторичных структур. Очень быстро такие последовательности начнут складываться в разнообразные структуры с многочисленными шпильками. Причем каждый такой палиндромный повтор может сложиться не одним, а несколькими разными способами (в зависимости от того, какой из палиндромных блоков спарится с каким). В этом могут участвовать и несколько молекул одновременно, так что разнообразие возникающих структур (с потенциальными функциями) будет стремительно расти.  При этом будут периодически возникать свободные, одноцепочечные 5’-кончики, которые будут служить  матрицами для самоудлинения свернутой последовательности. Везде, где 3’-конец будет ложиться на матрицу, которая продолжается после него, там будет идти НР, т.е. будет происходить удлинение, рост палиндромного повтора.

В одних микрополостях (или мембранных пузырьках) могут размножиться одни палиндромные повторы, в других другие. Из-за неточности НР будут возникать мутации – палиндромы будут становиться локально несовершенными; сильное несовершенство замедлит НР (т.е. будет отсеяно отбором), слабое может сохраниться и распространиться за счет дрейфа; будут возникать компенсирующие мутации, восстанавливающие совершенство палиндрома; в общем, разнообразие будет расти.

Наращивание цепочек может происходить не спеша, постепенно: здесь два нуклеотида пристроилось,  там четыре, тут один (за один цикл горячо – холодно), ничего страшного: в следующем цикле рост продолжится. Во многом это снимает проблему медленности НР.

Главные достоинства модели «палиндромного мира», по-видимому, следующие:

1) Снимается проблема праймеров (она перестает быть проблемой и становится двигателем отбора в пре-РНК-мире);

2) Обеспечивается рост и размножение последовательностей, которые очень легко будут образовывать разнообразные вторичные структуры (любая шпилька – это же, ясное дело, палиндром), что резко повышает вероятность появления функциональных рибозимов;

3) Закрученность в шпильки повышает устойчивость молекул РНК; они будут медленнее деградировать;

4) Даже самый ничтожный случайный обрывок последовательности не пропадет, а послужит для дальнейшего роста цепочек: ведь он очень легко найдет себе комплементарную матрицу (кругом полно подходящих цепочек!), к которой он прилипнет и послужит праймером.

Ну а дальше в какой-то прекрасный момент в какой-то микрополости или протоклетке появляется такой палиндром-мутант, который хоть чуть-чуть, хоть капельку будет ускорять (катализировать) НР. Возможно, этот палиндром-мутант сможет взаимодействовать с каким-нибудь пептидом с несколькими остатками аспарагиновой кислоты, которые удерживают один или два иона магния или цинка. Да, содружество РНК с пептидами должно было, мне кажется, тоже зародиться раньше, чем появились эффективные рибозимы-полимеразы.

С этого момента – с появления, пусть в самом зачаточном виде, РНК-полимерзаной функции, и начинается переход от «палиндромного мира» к настоящему (зрелому) «миру РНК».

Литература

Attwater J., Wochner A., Holliger P. 2013. In-ice evolution of RNA polymerase ribozyme activity // Nature Chemistry.

Briones C., Stich M., Manrubia S.C. 2009. The dawn of the RNA World: Toward functional complexity through ligation of random RNA oligomers // RNA. V. 15. P. 743-749. doi:10.1261/rna.1488609

Huang W., Ferris J.P. 2006. One-step, regioselective synthesis of up to 50-mers of RNA oligomers by montmorillonite catalysis // J. Am. Chem. Soc. 128: 8914–8919.

Lincoln T.A., Joyce G.F. 2009. Self-Sustained Replication of an RNA Enzyme // Science.

Paul N., Joyce G.F. 2002. A self-replicating ligase ribozyme // PNAS. V. 99. P. 12733–12740. doi: 10.1073/pnas.202471099

Inoue T., Orgel L.E. 1983. A Nonenzymatic RNA Polymerase Model // Science. V. 219. P. 859-862.

Jack W Szostak. 2012. The eightfold path to non-enzymatic RNA replication // Journal of Systems Chemistry. V. 3. P. 2.

Acevedo O.L., Orgel L.E. 1987. Non-enzymatic transcription of an oligodeoxynucleotide 14 residues long. J Mol Biol 197:187-193.

Orgel L.E. 2004. Prebiotic chemistry and the origin of the RNA world. Crit Rev Biochem Mol Biol, 39: 99-123.

Adamala K., Szostak J.W. 2013. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells // Science. V. 342. P. 1098–1100.

Eigen M. 1971. Self-organization of matter and the evolution of biological macromolecules. Naturwissenschaften  58: 465-523.

Leu K., Obermayer B., Rajamani S., Gerland U., Chen I.A. 2011. The prebiotic evolutionary advantage of transferring genetic information from RNA to DNA. Nuc Acids Res  39: 8135-8147.

Horowitz ED, Engelhart AE, Chen MC, Quarles KA, Smith MW, Lynn DG, Hud NV. 2010. Intercalation as a means to suppress cyclization and promote polymerization of base-pairing oligonucleotides in a prebiotic world. Proc Natl Acad Sci USA, 107: 5288-5293.

James KD, Ellington AD. 1997. Surprising fidelity of template-directed chemical ligation of oligonucleotides. Chem Biol, 4: 595-605.

C. Butch et al., 2013. Production of Tartrates by Cyanide-Mediated Dimerization of Glyoxylate: A Potential Abiotic Pathway to the Citric Acid Cycle

Konstantin Bokov, Sergey V. Steinberg. 2009. A hierarchical model for evolution of 23S ribosomal RNA // Nature. V. 457. P. 977–980.

Ricardo A, Szostak JW. 2009. Origin of life on earth. Sci Am, 301:54-61.

Engelhart A.E., Powner M.W., Szostak J.W. 2013. Functional RNAs exhibit tolerance for non-heritable 2′–5′ versus 3′–5′ backbone heterogeneity // Nature Chemistry 5, 390–394. doi:10.1038/nchem.1623

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

  • 47 comments